Validation of a new method for the detection of Ethyl glucuronide in larvae of Lucilia sericata as a marker of ante-mortem alcohol consumption.

Larvae and insects are an important and alternative biological matrix in the development anpost-mortem forensic toxicology. They are very useful when conventional matrices are not available, in particular when the loss of biological fluids, due to the decomposition of corpses or to a traumatic death, occurs. The purpose of this study is to develop and validate an analytical method in Ultra High-Performance Liquid Chromatography at High Resolution Mass Spectrometry (HPLC/HR-MS) for the research and quantification of Ethyl glucuronide (EtG) on larvae. The criteria taken into consideration for the validation are linearity, quantitation limits (LOD and LLOQ), accuracy, precision, carryover, interferences and ionization suppression/enhancement. The method was shown to be linear within the tested range, with a coefficient of determination higher than 0.99. LOD was 2 pg mg-1, while LLOQ was 5 pg mg-1. Accuracy, precision and ionization/suppression enhancement fulfilled the criteria indicated in the guidelines used for the validation. The establishment and validation of this method allowed the identification of Ethyl glucuronide on the larvae of Lucilia sericata (Calliphoridae) of a subject found death in an advanced state of decomposition.

Quantification of biogenic amines in fabrication steps of Gorgonzola-type cheese / Quantificação de aminas biogênicas nas etapas de fabricação do queijo tipo Gorgonzola

During the Gorgonzola-type cheese preparation there are proteolysis and lipolysis which may be influenced by the type of starter culture chosen. Six manufacturing steps were selected to identify which of them is most suitable for biogenic amines (BA) formation (1- milk, 2- lactic acid bacterial culture and fungus addition, 3- curd, 4- dry salting, 5- maturation at 30 days and maturation at 60 days); perform research on enterobacteria; accomplish the research of BA-producing bacteria (BAPB); detect and quantify the most abundant BA (putrescine, cadaverine, tyramine, histamine, spermidine and spermine) in the six steps of Gorgonzola cheese production and in bacterial isolates using high performance liquid chromatography and UV-Vis SPD/10AV detector and define if the presence of enterobacteria and BAPB would be correlated with BA production in this cheese. The bacterial culture used increased its log population by 7 log cycles and reached its highest level in batch 2 during cheese maturation. There was a decrease in the enterobacterial population in 2 log cycles after 60 days of maturation in batch 1. Tyramine was the BA with the highest concentration 306.32 mg.Kg-1 quantified in step 6 (60 days maturation) in batch 1. Criterion is requiered in bacterial starter culture selection because it is a quality determinant factor in relation to BA production and more rigor in raw material

Durante a elaboração do queijo tipo Gorgonzola ocorre proteólise a partir das bactérias e dos fungos adicionados ao leite que podem levar a formação de aminas biogênicas (AB) neste tipo de queijo. Portanto, no presente estudo foi feito o acompanhamento com coleta de amostras em seis etapas na fabricação deste queijo paraidentificar em qual delas haveria maior formação de aminas biogênicas (AB). As amostras coletadas em três diferentes lotes foram o leite cru (1), leite pasteurizado adicionado de cultura de bactérias ácido-láticas (2), massa coalhada (3), queijo após a etapa de salga seca (4), queijo após 30 dias de maturação (5) e queijo após 60 dias de maturação (6). Também foram realizadas a pesquisa de enterobactérias e bactérias ácido-láticas com característica capacidade de descarboxilação de aminoácidos e produção de aminas biogênicas (BPAB); detecção e quantificação da AB mais abundante (putrescina, cadaverina, tiramina, histamina, espermidina e espermina) nas seis etapas de fabricação do queijo tipo Gorgonzola e nos isolados bacterianos utilizando cromatografia líquida de alta eficiência e detector UV-Vis SPD/10AV e a verificação se a presença de enterobactérias e BPAB estariam correlacionadas com a produção de AB nesse queijo. A cultura bacteriana utilizada cresceu aumentando em sete ciclos logarítmicos sua população e alcançou seu maior nível no lote 2 na etapa de maturação do queijo. Houve diminuição da população enterobactérias em 2 ciclos logarítmicos após 60 dias de maturação no lote 1. A tiramina foi a AB com concentração mais elevada 306,32 mg.Kg-1 quantificada na etapa 6 (60 dias de maturação) no lote 1. É necessário dar mais atenção em duas etapas na elaboração dos queijos: mais critério na seleção da cultura bacteriana iniciadora por ser um fator determinante na qualidade em relação à produção de AB e mais rigor na seleção da matéria-prima.

Quantification of biogenic amines in fabrication steps of Gorgonzola-type cheese / Quantificação de aminas biogênicas nas etapas de fabricação do queijo tipo Gorgonzola

During the Gorgonzola-type cheese preparation there are proteolysis and lipolysis which may be influenced by the type of starter culture chosen. Six manufacturing steps were selected to identify which of them is most suitable for biogenic amines (BA) formation (1- milk, 2- lactic acid bacterial culture and fungus addition, 3- curd, 4- dry salting, 5- maturation at 30 days and maturation at 60 days); perform research on enterobacteria; accomplish the research of BA-producing bacteria (BAPB); detect and quantify the most abundant BA (putrescine, cadaverine, tyramine, histamine, spermidine and spermine) in the six steps of Gorgonzola cheese production and in bacterial isolates using high performance liquid chromatography and UV-Vis SPD/10AV detector and define if the presence of enterobacteria and BAPB would be correlated with BA production in this cheese. The bacterial culture used increased its log population by 7 log cycles and reached its highest level in batch 2 during cheese maturation. There was a decrease in the enterobacterial population in 2 log cycles after 60 days of maturation in batch 1. Tyramine was the BA with the highest concentration 306.32 mg.Kg-1 quantified in step 6 (60 days maturation) in batch 1. Criterion is requiered in bacterial starter culture selection because it is a quality determinant factor in relation to BA production and more rigor in raw material selection.

Durante a elaboração do queijo tipo Gorgonzola ocorre proteólise a partir das bactérias e dos fungos adicionados ao leite que podem levar a formação de aminas biogênicas (AB) neste tipo de queijo. Portanto, no presente estudo foi feito o acompanhamento com coleta de amostras em seis etapas na fabricação deste queijo paraidentificar em qual delas haveria maior formação de aminas biogênicas (AB). As amostras coletadas em três diferentes lotes foram o leite cru (1), leite pasteurizado adicionado de cultura de bactérias ácido-láticas (2), massa coalhada (3), queijo após a etapa de salga seca (4), queijo após 30 dias de maturação (5) e queijo após 60 dias de maturação (6). Também foram realizadas a pesquisa de enterobactérias e bactérias ácido-láticas com característica capacidade de descarboxilação de aminoácidos e produção de aminas biogênicas (BPAB); detecção e quantificação da AB mais abundante (putrescina, cadaverina, tiramina, histamina, espermidina e espermina) nas seis etapas de fabricação do queijo tipo Gorgonzola e nos isolados bacterianos utilizando cromatografia líquida de alta eficiência e detector UV-Vis SPD/10AV e a verificação se a presença de enterobactérias e BPAB estariam correlacionadas com a produção de AB nesse queijo. A cultura bacteriana utilizada cresceu aumentando em sete ciclos logarítmicos sua população e alcançou seu maior nível no lote 2 na etapa de maturação do queijo. Houve diminuição da população enterobactérias em 2 ciclos logarítmicos após 60 dias de maturação no lote 1. A tiramina foi a AB com concentração mais elevada 306,32 mg.Kg-1 quantificada na etapa 6 (60 dias de maturação) no lote 1. É necessário dar mais atenção em duas etapas na elaboração dos queijos: mais critério na seleção da cultura bacteriana iniciadora por ser um fator determinante na qualidade em relação à produção de AB e mais rigor na seleção da matéria-prima.Palavras chaves: cromatografia, cultura iniciadora, detector SPD/10AV UV­Vis, maturação, tiramina.

Production of Naturally γ-Aminobutyric Acid-Enriched Cheese Using the Dairy Strains Streptococcus thermophilus 84C and Lactobacillus brevis DSM 32386.

The cheese-derived strains Streptococcus thermophilus 84C isolated from Nostrano cheese, and Lactobacillus brevis DSM 32386 isolated from Traditional Mountain Malga cheese have been previously reported as γ-aminobutyric acid (GABA)-producers in vitro. In the present study, the ability of these strains to produce GABA was studied in experimental raw milk cheeses, with the aim to investigate the effect of the culture and the ripening time on the GABA concentration. The cultures used consisted on S. thermophilus 84C alone (84C) or in combination with L. brevis DSM 32386 (84C-DSM). The control culture was a commercial S. thermophilus strain, which was tested alone (CTRL) or in combination with the L. brevis DSM 32386 (CTRL-DSM). The pH evolution, microbiological counts, MiSeq Illumina and UHPLC-HQOMS analysis on milk and cheese samples were performed after 2, 9, and 20 days ripening. During the whole ripening, the pH was always under 5.5 in all batches. The concentration of GABA increased during ripening, with the highest content in 84C after 9 days ripening (84 ± 37 mg/kg), in 84C-DSM and CTRL-DSM after 20 days ripening (91 ± 28 and 88 ± 24 mg/kg, respectively). The data obtained support the hypothesis that S. thermophilus 84C and L. brevis DSM 32386 could be exploited as functional cultures, improving the in situ bio-synthesis of GABA during cheese ripening.

Metabolomic analysis identifies altered metabolic pathways in Multiple Sclerosis.

Multiple sclerosis (MS) is a chronic, demyelinating disease that affects the central nervous system and is characterized by a complex pathogenesis and difficult management. The identification of new biomarkers would be clinically useful for more accurate diagnoses and disease monitoring. Metabolomics, the identification of small endogenous molecules, offers an instantaneous molecular snapshot of the MS phenotype. Here the metabolomic profiles (utilizing plasma from patients with MS) were characterized with a Gas cromatography-mass spectrometry-based platform followed by a multivariate statistical analysis and comparison with a healthy control (HC) population. The obtained partial least square discriminant analysis (PLS-DA) model identified and validated significant metabolic differences between individuals with MS and HC (R2X=0.223, R2Y=0.82, Q2=0.562; p<0.001). Among discriminant metabolites phosphate, fructose, myo-inositol, pyroglutamate, threonate, l-leucine, l-asparagine, l-ornithine, l-glutamine, and l-glutamate were correctly identified, and some resulted as unknown. A receiver operating characteristic (ROC) curve with AUC 0.84 (p=0.01; CI: 0.75-1) generated with the concentrations of the discriminant metabolites, supported the strength of the model. Pathway analysis indicated asparagine and citrulline biosynthesis as the main canonical pathways involved in MS. Changes in the citrulline biosynthesis pathway suggests the involvement of oxidative stress during neuronal damage. The results confirmed metabolomics as a useful approach to better understand the pathogenesis of MS and to provide new biomarkers for the disease to be used together with clinical data.

Cross-column prediction of gas-chromatographic retention indices of saturated esters.

We combine computational molecular descriptors and variables related with the gas-chromatographic stationary phase into a comprehensive model able to predict the retention of solutes in external columns. To explore the quality of various approaches based on alternative column descriptors, we analyse the Kováts retention indices (RIs) of 90 saturated esters collected with seven columns of different polarity (SE-30, OV-7, DC-710, OV-25, XE-60, OV-225 and Silar-5CP). Cross-column retention prediction is evaluated on an internal validation set consisting of data of 40 selected esters collected with each of the seven columns, sequentially excluded from calibration. The molecular descriptors are identified by a genetic algorithm variable selection method applied to a large set of non-empirical structural quantities aimed at finding the best multi-linear quantitative structure-retention relationship (QSRR) for the column OV-25 having intermediate polarity. To describe the columns, we consider the sum of the first five McReynolds phase constants and, alternatively, the coefficients of the corresponding QSRRs. Moreover, the mean RI value for the subset of esters used in QSRR calibration or RIs of a few selected compounds are used as column descriptors. For each combination of solute and column descriptors, the retention model is generated both by multi-linear regression and artificial neural network regression.

Estudo de bioequivalência entre duas formulações de ciprofibrato 100 mg comprimidos em voluntários sadios após administração de dose única / Bioequivalence study between two formulations of ciprofibrate 100 mg tablets in healthy volunteers after single dose administration

A comparação da biodisponibilidade de duas formulações de ciprofibrato 100 mg comprimidos (ciprofibrato 100 mg - Aché Laboratórios Farmacêuticos S/A, formulação teste, e Oroxadin® 100 mg - Sanofi-Aventis Farmacêutica Ltda., formulação referência) foi realizada por meio de um estudo de bioequivalência em 52 voluntários sadios. O estudo foi realizado através de um delineamento aberto, randomizado, em dose única, cruzado em dois períodos e com tempo de washout de nove semanas. As amostras de plasma foram obtidas durante um intervalo de tempo de 72 horas. As concentrações plasmáticas de ciprofibrato foram determinadas por cromatografia líquida de alta eficiência com detecção por espectrometria de massas (CLAE-MS/MS), com ionização por electrospray em modo positivo. Os parâmetros farmacocinéticos área sob a curva (ASC0-72), concentração plasmática máxima (Cmax) e tempo máximo (Tmax) foram obtidos a partir da curva de concentração plasmática do ciprofibrato versus tempo. As razões das médias geométricas com intervalo de confiança 90% após transformação logarítmica foram 89,43% (85,09% - 93,99%) para Cmax e 97,23% (94,73% - 99,79%) para ASC0-72. As formulações teste e referência são consideradas bioequivalentes se os intervalos com 90% de confiança para a média geométrica da razão teste/referência ficarem compreendidos na faixa de 80% a 125%. Dessa forma os comprimidos de ciprofibrato 100 mg testados (Aché Laboratórios Farmacêuticos S/A) foram bioequivalentes aos comprimidos de Oroxadin® 100 mg, de acordo com taxa e extenção de absorção.

Estudo comparativo da veiculação do diclofenaco sódico pela fonoforese de alta e baixa frequência em ratos / Comparative study of sodic diclofenaco veiculation by fonoforesis using high and low frequency in rats

Objetivo: estudar a aplicação do ultrassom terapêutico com alta frequência-3MH em estudo comparativo com aplicação do ultrassom terapêutico de baixa frequência-1MHz, na indução do aumento na absorção transcutânea do diclofenaco de sódio pela pele de ratos. Método: estudo experimental utilizando 15 ratos machos, adultos, da linhagem Wistar, com peso entre 250 a 350 gramas, distribuídos em três grupos: Alta, Baixa Frequência e Controle de 5 ratos cada. Foram coletadas 4 amostras de sangue de cada animal, nos tempos de 0? antes da aplicação do ultrassom, 30?, 60? e 90? minutos após a realização da técnica específica para cada grupo. Na leitura das amostras, foi utilizado o equipamento de Cromatografia Líquida de Alta Eficiência-CLAE. Resultado: a análise foi obtida através do método não paramétrico, ANOVA de Kruskal-Wallis, não comprovando diferença estatisticamente significante entre os grupos analisados no que diz respeito a maior absorção do fármaco. Conclusão: os resultados obtidos sugerem novos estudos, que busquem aperfeiçoar o método aplicado e possa agregar maiores conhecimentos ao assunto pesquisado o que possibilitará resultados cada vez mais precisos.

Objective: to study the application of therapeutic ultrasound with high frequency-3MH in a comparative study with application of therapeutic ultrasound, low-frequency 1MHz-induced increase in transcutaneous absorption of diclofenac sodium by the skin of mice. Method: an experimental study using 15 male rats, adult male rats, weighing 250 to 350 grams were divided into three groups: High, Low Frequency Control and 5 mice each. We collected 4 blood samples from each animal at 0 'prior to the application of ultrasound, 30', 60 'and 90' minutes after the completion of specific techniques for each group. In reading the samples, we used the equipment Chromatography High Performance Liquid-HPLC. Result: the analysis was performed using the method nonparametricANOVA Kruskal-Wallis test does not confirm a statistically significant difference between the groups with regard to the greater absorption of the drug. Conclusion: the results suggest further studies that seek to improve the methodology used, and may add more knowledge to the subject researched the results will enable more precise.

Rendimento e composição química do óleo essencial da camomila [Chamomilla recutita (L. ) Rauschert] submetida à secagem à 70º C / Essential oil yield and chemical composition of chamomile [Chamomilla recutita (L. ) Rauschert] under drying air temperature of 70º C

Com o objetivo de avaliar o rendimento e a composição química do óleo essencial de camomila, monitorouse periodicamente o processo de secagem em camada fixa à 70º C, realizada no município de Campo Largo– PR, num secador da “CHAMEL Ind. e Com. de Produtos Naturais LTDA.”, na safra de 2004. Simultaneamente à secagem, as substâncias arrastadas pelo vapor d’água foram recuperadas por condensação. As determinações analíticas foram realizadas nos Laboratórios de Fitoquímica e de Análisesde Combustíveis Automotivos - LACAUT, por meio da hidrodestilação e cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas. Os dados foram avaliados por meio de regressões polinomiais (P£0,01). A redução do teor de água da camomila foi progressiva durante o processo de secagem; a redução do teor de óleo essencial da camomila ocorreu no início da secagem; é possível recuperar as substâncias volatilizadas durante a secagem à 70º C; na água aromática (condensado) foram identificados: artemísia cetona, oxido de bisabolol B, alfa-bisabolol, oxido de bisaboleno e oxido de bisabolol A; a concentração dos componentes, exceto para o alfa-pineno, do óleo essencial da camomila são alterados apenas numericamente, sem comportamento peculiar em relação às condições de tempo de secagem.

The drying process under 70º C was periodically monitored, in Campo Largo-PR, in “CHAMEL Ind. eCom. de Produtos Naturais LTDA.”, in the 2004 harvest. Simultaneously to the drying, the substancesdragged by the steam of water were recovered by condensation. The hydrodistillation and GC-MSanalyses were done in the UFPR Laboratories. A randomized experimental design was used, throughpolynomials regressions (P£0,01). The reduction of the water content and chamomile essential oil wasprogressive during the drying process; the reduction of the tenor of essential oil of the chamomilehappens in the beginning of the drying; was possible to recover the substances volatilized during under70º C drying temperature; the aromatic water (condensed) composition was: artemisia ketona, bisabololoxide B, alpha-bisabolol, bisabolene oxide, bisabolol oxide A; the essential oil components concentrationof the chamomile, except for the alpha-pinene, were just numerically altered, without peculiar behavior inrelation to the conditions of drying time.